原位杂交技术在检测HBV核酸和cccDNA中的应用

临床肝胆病杂志 临床肝胆病杂志
徐通, 张小楠, 袁正宏

复旦大学隶属上海市公众卫生临床中心


HBV传染今朝仍是一个严重的公众卫生问题,威胁着人类的健康。据世界卫生组织报道,全球现有2.57亿慢性HBV传染者,每年约有88.7万人死于HBV传染所导致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。HBV是正链不完整的部门双链DNA病毒,属嗜肝DNA病毒家眷,家眷中还包括鸭乙型肝炎病毒(DHBV)和土拨鼠肝炎病毒(WHV)等。HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)以超螺旋微小染色体形式存在于肝细胞核内,是启动病毒RNA转录和后续翻译、复制的关键模板,是维持HBV慢性传染状况的关键成分,且cccDNA组织高度不乱,难以覆灭。检测cccDNA对进一步熟悉HBV的致病机制及指导抗病毒药物使用有首要意义,但传统的检测手段存在活络度或特异度方面的不足,并且只能反映出样本中cccDNA的平均水平。原位杂交锋艺(ISH)在研究cccDNA的组织分布、丰度改变等方面有着首要意义,可为HBV的研究供给新信息,现就近年来ISH的成长以及在慢性乙型肝炎中的应用综述如下。




1  HBV复制特点和cccDNA的生物学特征


HBV基因组全长为3.2 kb,其成熟病毒颗粒以松懈环状DNA(rcDNA)的形式存在。当HBV传染宿主肝细胞时,在NTCP等受体的介导下进入肝细胞胞浆,rcDNA脱去连络于其负链的HBV聚合酶pol成为脱蛋白松懈环状DNA (PF-rcDNA),随后核衣壳解聚,并释放PF-rcDNA至细胞核中。胞核中的PF-rcDNA经由进一步修复,形成超螺旋的cccDNA。HBV以cccDNA 作为模板转录出病毒亚基因组RNA,于胞浆中翻译成病毒各蛋白,个中转录出的pgRNA不单作为mRNA翻译发生病毒聚合酶pol及核心蛋白Core,还作为逆转录模板被包装于核心颗粒中,从而形成成熟的核心颗粒,随后被外膜蛋白包裹发生子代病毒粒子释放至胞外。此外,新生的成熟核心颗粒还可再次入核,扩充细胞的 cccDNA 保留库。已有的大量研究提醒HBV cccDNA高度不乱是HBV持续传染的关键。


今朝临床上用于治疗慢性乙型肝炎的药物首要有两类,即干扰素和核苷相同物。干扰素治疗中,约有30%~40%的患者发生HBV DNA阴转,HBeAg血清转换的病毒学应答,有不到10%的患者可发生HBsAg阴转,但其副浸染较多,且不适用于失代偿期乙型肝炎患者。核苷相同物对HBV复制的按捺究竟较好,但无法覆灭cccDNA,HBsAg覆灭率极低,停药后随意反弹,是以需耐久服药。HBV cccDNA水平是指导临床慢性乙型肝炎抗病毒治疗的首要依据之一,cccDNA的覆灭也是抗病毒治疗希望达到的最佳终点之一。若何有效耗竭或覆灭肝脏中残存的cccDNA,是今朝着眼于治愈乙型肝炎的药物、免疫治疗研究的首要方针。



2  HBV cccDNA检测的手艺难题


对肝细胞内HBV cccDNA的监测被认为是评估抗病毒药物疗效以及临床治愈的金标准。然则,HBV cccDNA的定量检测存在一系列难点。首先,缺乏合适的研究模型,经由对DHBV的研究,已经对cccDNA的形成及维持有了简略的熟悉,但它不克反映慢性乙型肝炎患者体内真实的景遇。其次,慢性传染者肝穿刺标本对照珍贵,且相对DHBV、WHV慢性传染标本,HBV cccDNA含量较低(0.1~1拷贝/细胞)。更首要的是,今朝缺乏既活络准确又把握简便的检测手艺。Southern blot是检测cccDNA的传统体式,虽然其受到遍及的承认,但此法活络度低,把握复杂,不适用于大量临床标本的检测;而后期斥地的cccDNA特异性实时荧光定量PCR(qPCR)活络度高,把握便捷,但其特异性有待提高。此外,考虑到 cccDNA在患者肝组织内的分布是不均一的,传统的定量检测体式只能反映出其平均水平,无法浮现其在空间上的定位信息,是以亟需斥地特异度、活络度更高的,且反映cccDNA空间定位信息的检测体式。



3  ISH的成长及在病毒学研究中的应用


ISH是将特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或许组织切片中核酸进行杂交并对其进行检测的体式,能够在细胞和染色体水平上浮现特异性核酸的分布及其意义。1969年,Pardue和Gall行使放射性同位素标记的RNA探针成功检测到非洲爪蟾细胞核内的rDNA,同年John等使用的放射性标记探针,行使放射自显影检测一些高度频频序列DNA在染色体上的定位,开创了ISH这一全新手艺。不过,因为同位素标记探针存在放射性污染、不乱性差、把握耗时等瑕玷,科学家们逐渐起头研究非放射性标记物来替代同位素。1981年,Bauman等将RNA 探针的3′端用荧光素进行标记,并检测到了目的DNA。同年,Langer等首次采用了生物素标记核苷酸探针,并成功地进行了染色体原位杂交,竖立了非放射性ISH。1987年, Boeringer Mannheim公司将地高辛标记的有关试剂投放市场。非放射性标记探针(生物素、地高辛等)使得ISH加倍安然随意,且提高了不同率,逐渐替代了放射性标记探针。


跟着手艺成长,ISH与其他手艺连络,在病毒学研究方面施展了首要浸染。Haase等于1990年竖立了一种将PCR手艺和ISH相连络的原位多聚酶链式回响手艺 (in situ PCR),对比传统的ISH,该手艺可将传染细胞中梅迪-维斯纳病毒DNA检测的活络度提高2个数量级。


在定量PCR手艺展现之前,Chiron公司斥地的支链DNA(branched DNA,bDNA)旗子放大手艺曾是病毒载量检测的主导手艺。bDNA手艺是一种不依靠分子扩增的核酸杂交旗子放大检测手艺。当探针特异捕获方针核酸后,可连络多个酶标记物的bDNA与探针连络,进而经由分支上酶标记物的发光获得放大的靶标旗子,从而大大提高了原位杂交的活络度,同时也可保证检测的高特异度。bDNA可实现HIV-1 RNA、HBV DNA、HCV RNA等病毒核酸的高活络度定量。在组织切片水平,bDNA手艺也浮现了精巧的旗子放大能力,例如针对人乳头瘤病毒设计的探针可检测到病毒的mRNA与DNA,并在同化细胞中成功区分人乳头瘤病毒的不合亚型。由Panomics研发推广的ViewRNA系列试剂盒就是基于bDNA放大机制的单细胞单拷贝级别活络度的ISH。其首要特点是采用了特异性的双Z探针,避免了传统长链RNA探针的偏差,提高了特异度,配以级联放大检测事理,可以高效敏感地检测到方针RNA。



4  ISH应用于HBV核酸检测的进展


ISH对解说肝内病毒的撒布和分布, 病毒的复制机理, 致癌和致病机理等研究起着十分首要的浸染。是以,行使高活络度的ISH检测肝组织切片上病毒核酸的旗子及空间分布显得非常需要。



4.1  ISH检测HBV DNA、RNA


1981年,Gowans等应用放射性同位素标记探针,检测HBV传染肝细胞内的HBV DNA,首次将ISH引入HBV的研究。行使ISH检测HBV DNA可以视察到其在肝组织内分布特点,ISH还可以与免疫组化相连络,在统一份组织样本上同时浮现出胞内核酸与抗原的定位信息,从而反映不合病程中肝内HBV DNA分布的改变景遇,匡助进一步熟悉HBV生活周期。


为了进一步提高ISH检测组织中HBV DNA活络度,稀奇是组织中低拷贝的核酸,Nuriya等经由设计特异性探针,调节蛋白酶的种类、浓度和处理时间,把握PCR轮回数等体式优化实验前提,提高了原位PCR特异度,成功在传染组织中定位出DNA与RNA,并经由多次实验证实该体式的频频性较好。原位PCR有着更高的活络度,然则特异度仍然是个挑战。


对比原位PCR,基于bDNA的旗子放大手艺在检测HBV DNA及RNA时更有一系列优势:(1)无需经受温度轮回,更好留存样起原始形态;(2)不用考虑组织中存在酶按捺剂而影响PCR扩增效率的景遇;(3)避免了交叉污染或许扩增产物向临近细胞扩散。这些手艺为临床医生供给了直接定量定位HBV DNA及RNA的能力,在HBV根本病毒学的研究和临床应用中非常适用。



4.2  ISH检测HBV cccDNA


在1998年,Yeh等首次报道了将ISH用于cccDNA检测,研究者在整合有HBV基因组的HepG2细胞中,用地高辛标记的RNA探针检测到了cccDNA,但该系统未在肝组织中验证。Zhong等还考试了将连络滚环扩增(RCA)与原位PCR相连络,在RCA处理之后采用5′端标记地高辛的cccDNA特异探针进行原位PCR,最终可以实现单个细胞内检测到2个拷贝cccDNA的活络度,可反映出cccDNA水平与肝组织病理学特征的关系,从而评价抗病毒治疗究竟。但该方案中还有些不足,比如原位PCR或许导致扩增的DNA产物扩散莅临近细胞,以及交联的组蛋白或其他cccDNA连络蛋白或许阻碍PCR的有效扩增。


2016年,本课题组改善了ViewRNA手艺,在bDNA旗子扩增手艺底细上二次斥地,成功竖立了一种能在组织水平浮现cccDNA分布的ISH。该方案设计了3组探针拜别针对HBV DNA正链、负链以及rcDNA正链的缺口处,经由响应的酶处理,可以特异地检测到HBV DNA(正链或负链)、HBV RNA(pgRNA或总HBV RNA)以及cccDNA。同时该体式可以与HBV首要抗原的免疫组化或免疫荧光连络,获得了病毒核酸与抗原的综合图像,并由此提出了在单细胞水平HBV存在“抗原富集期”“DNA富集期”和“隐蔽期”的三阶段假说,为进一步针对患者不合病情设计覆灭HBV cccDNA供给理论底细。当然,该体式也存在一些局限性,比如在HBV的生活周期中或许发生HBV DNA整合到基因组的景遇,而该方案中的cccDNA检测探针无法区分cccDNA与整合DNA。



4.3  荧光ISH检测HBV cccDNA


上述ISH常日使用化学显色法,虽然此法在临床应用较广,但其空间不同率具有必然限制,无法揭示核酸在亚细胞组织中的精彩定位。而荧光标记探针经由宽场显微镜成像的理论不同率可达200 nm摆布,是以荧光ISH可获得病毒在细胞内高不同率图像。Li等竖立了以生物素标记探针、荧光标记亲和素为底细的FISH检测系统,拜别在模拟有无抗病毒治疗的景遇下,观测DHBV cccDNA与HBV核内DNA在细胞割据时的命运。该研究有助于加深对HBV生活周期的懂得,有助于未来进一步确认cccDNA在核内储藏区域的研究。此外,本课题组也在前期工作底细上,在bDNA放大系统的最后一步改为荧光标记的Label probe,竖立了一套荧光ISH,在HBV复制系统HepAD38及传染系统HepG2-NTCP中,使用3D-STORM 和3D-SIM成像系统,获得了HBV RNA和DNA的图像,提高了空间不同率,有助于进一步理会HBV在宿主细胞内撒布过程中的关键分子事件,并验证cccDNA维持和转录的关键表观调控因子。因为细胞培养系统中存在正链相对完整的rcDNA,是以无法完全确保针对正链缺口区域的探针对cccDNA的特异性。尽管如斯,凭借FISH的高不同率,可行使cccDNA染色质化的特点,经由与组蛋白的合营染色,确定核内HBV DNA的分子性质。HBV荧光ISH的竖立将匡助研究者深入商酌病毒传染、扩增周期中关键事件(cccDNA转录,pgRNA翻译与核衣壳包装、病毒成熟释放等)的分子机制,为剖断病毒复制关键宿主因子、斥地新一代抗病毒药物供给线索。



5  挑战与瞻望


ISH对比其他传统的HBV核酸和cccDNA检测手艺,首要优势在于能够浮现各类型核酸在组织上的位置分布和丰度改变,为HBV发病机制研究供给组织学信息。HBV DNA与cccDNA的ISH有望与病毒抗原的免疫组化相连络,纳入到慢性乙型肝炎临床病理常规搜检。当然,要达莅临床应用,相关手艺在检测活络度以及特异度方面仍需进一步提高。


在乙型肝炎相关临床、底细研究方面,ISH拥有多项奇异的优势。首先,ISH可与其他检测体式,如免疫组化与稀奇染色联用,以获取病毒复制与慢性乙型肝炎组织学进展的互相关系,未来也有望和其他新手艺(如单细胞质谱手艺、单细胞表达谱手艺等)连系运用,加深对病毒致病机制的懂得。其次,在乙型肝炎相关细胞、动物模型中,如将荧光ISH与超不同率显微成像手艺相连络,可获得HBV复制过程中一些关键过程的纳米尺度图像,为病毒与宿主互相浸染以及药物靶标的深度研究供给了强有力的手艺底细。


总之,HBV核酸和cccDNA的原位检测对于临床评价慢性乙型肝炎疾病状况,指导抗病毒药物运用以及深入研究HBV生活周期等方面,有着非常首要的意义。ISH的进一步优化无疑将加速上述研究的进展。





引证本文XU T, ZHANG XN, YUAN ZH. Application of in situ hybridization in the detection of hepatitis B virus nucleic acids and cccDNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1197-1200. (in Chinese) 

徐通, 张小楠, 袁正宏. 原位杂交锋艺在检测HBV核酸和cccDNA中的应用[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(6): 1197-1200.


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本文编纂:王亚南

微信编纂:邢翔宇


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